|
|
Mutageneze a exprese proteinu NKp80, aktivačního receptoru lidských lymfocytů
Pazderová, Kristýna ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Ječmen, Tomáš (oponent)
Předmětem této práce je receptor NKp80, také známý jako KLRF1 (z angl. killer cell lectin-like subfamily F, member 1). Je to aktivační receptor tvořící homodimery na povrchu NK buněk. Váže se na ligand AICL, který se přirozeně nachází na myeloidních buňkách. Pokud dojde k výraznému navýšení exprese ligandu AICL, např. na nádorových buňkách, stává se buňka terčem pro NK buňky, které exprimují receptor NKp80. Komplex NKp80:AICL je potenciálním cílem imunoterapeutické léčby myeloidní leukémie. Cílem práce byla produkce a purifikace extracelulární domény receptoru NKp80 a jejích variant, kde v její části tzv. "stalk" oblasti byly jednotlivé cysteiny nahrazeny seriny. Pomocí zavedených mutací zde byl sledován vliv na tvorbu homodimerů. Proteiny byly produkovány za použití stabilně transfekovaných linií buněk HEK293S GnTI-. Celkem bylo produkováno sedm mutantů se všemi možnými kombinacemi mutací tří cysteinů "stalk" oblasti. Proteiny pak byly analyzovány pomocí analytické gelové permeační chromatografie, diferenční skenovací fluorimetrie, a nakonec byla pomocí deglykosylace ověřena přítomnost více glykosylačních forem receptoru NKp80. Z výsledků je zřejmé, že u žádné varianty receptoru NKp80 nedochází ke tvorbě kovalentních homodimerů, ale z hodnoty elučního objemu proteinu můžeme předpokládat, že v...
|
|
|
Příprava receptoru AICL ve fúzi s Fc fragmentem lidského IgG
Runová, Alžbeta ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Hlouchová, Klára (oponent)
NK buňky (z angl. "natural killer cells", přirozeně zabíječské buňky) jsou jedním ze základních prvků vrozené imunity. Hrají klíčovou roli v obraně proti virem infikovaným, nádorovým nebo jinak stresovaným buňkám. NK buňky mají na svém povrchu aktivační receptory spouštějící cytotoxické mechanismy vedoucí k apoptóze cílové buňky a inhibiční receptory zajišťující buněčnou toleranci. Rovnováha signálů NK buněčných receptorů určuje výslednou reakci NK buňky s cílovou buňkou. Mezi receptory podobné lektinům typu C patří aktivační receptor NKp80 a jeho ligand AICL. AICL je myeloidně specifický aktivační receptor exprimovaný na nádorových buňkách. Komplex NKp80:AICL podporující cytolýzu maligních myeloidních buněk je studován v souvislosti s imunoterapií nádorových onemocnění. Tato bakalářská práce popisuje přípravu vektorů obsahujících geny kódující expresní kostrukty AICL a následnou produkci proteinů v linii lidských embryonálních ledvinných buněk (HEK293S GnTI- ). Expresní konstrukty obsahují část extracelulární domény AICL, zásahové místo pro TEV proteasu a Fc fragment. Byly připraveny dva různé konstrukty - jeden obsahující nativní sekvenci AICL a druhý mutaci C87S.
|
|
|
Příprava lidského NK buněčného aktivačního receptoru NKp80 a jeho ligandu AICL
Kalousková, Barbora ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Ingr, Marek (oponent)
NK buňky (z angl. natural killer cells, přirozeně zabíječské buňky) hrají klíčovou roli při rozpoznávání a ničení nádorových, infikovaných nebo jinak pozměněných buněk. Na svém povrchu nemají antigenně specifické receptory, proto je řadíme mezi složky přirozené imunity. K rozpoznání cílových buněk slouží řada jiných povrchových receptorů. Inhibiční receptory zajišťují buněčnou toleranci, naopak aktivační receptory spouští cytotoxické mechanismy vedoucí k apoptóze a tedy lýzi buňky. Díky této vlastnosti jsou NK buňky intenzivně studovány v souvislosti s imunoterapií nádorových onemocnění. Jedním z aktivačních receptorů je NKp80 rozpoznávající svůj ligand AICL. Oba proteiny patří do rodiny receptorů podobných lektinům C-typu. Tento komplex se účastní nejenom přímé lýze maligních buněk myeloidního charakteru, ale má také důležitou roli v imunomodulaci zánětu. Předmětem této diplomové práce je příprava receptoru NKp80 a jeho ligandu AICL. Receptor NKp80 byl připraven v linii lidských embryonálních ledvinných buněk (HEK 293S GnTI- ). Byly připraveny stabilně transfekované linie produkující protein NKp80 konstitutivně nebo indukovatelně. Zapojení disulfidických můstků a obsazení N-glykosylačních míst proteinu NKp80 bylo ověřeno hmotnostní spektrometrií. Dále byl optimalizován postup Mgr. Jiřího Nového na...
|
|
|
Příprava a studium lidského NK buněčného receptoru AICL
Nový, Jiří ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Novák, Petr (oponent)
Přirozené zabíječské buňky neboli NK buňky jsou nedílnou součástí přirozené imunity a plní funkci rozpoznání a usmrcení nádorových a virem infikovaných buněk. Jejich funkce je regulována signály produkovanými díky interakci inhibičních a stimulačních receptorů na svém povrchu se svými specifickými ligandy na povrchu cílové buňky. Aktivačním receptorem je také NK receptor NKp80, který tvoří velmi specifický komplex s buněčným receptorem AICL, přičemž oba tyto receptory spadají do rodiny receptorů podobným lektinům C-typu. Zvýšená exprese receptoru AICL je přednostně specifická pro nádorové buňky myeloidního charakteru. Tato diplomová práce popisuje produkci mutované formy AICL expresí v bakteriích Escherichia coli BL21 Gold (DE3) a následnou izolaci a in vitro renaturaci cílového proteinu. V předchozí studii bylo zjištěno, že lichý počet cysteinů v extracelulární lektinové doméně AICL způsobuje špatné sbalení proteinu. Záměnou lichého cysteinu za serin v poloze 87 bylo dosaženo zisku stabilní rozpustné formy AICL se sudým počtem cysteinů v konzervovaných pozicích, charakteristickým pro receptory C-lektinového typu. Správnost tvorby disulfidových můstků mezi cysteiny byla ověřena hmotnostní spektrometrií. Zisk značného množství proteinu umožnil nasazení krystalizačních pokusů v širokém spektru...
|
host ::
RSS.